Neuer antiviraler Wirkmechanismus für ein von der FDA zugelassenes Thiopurin, bekannt als 6-Thioguanin
In einer kürzlich veröffentlichten Studie in PLoS-Erregerbeschrieben Forscher einen neuartigen antiviralen Wirkungsmechanismus für ein von der FDA (Food and Drug Administration) zugelassenes Thiopurin, das als 6-Thioguanin (6-TG) bekannt ist.
Lernen: Thiopurine hemmen die Verarbeitung von Coronavirus-Spike-Proteinen und den Einbau in Nachkommen-Virionen. Bildnachweis: Bacsica/Shutterstock
Hintergrund
Die Pandemie des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) hat die Bemühungen beflügelt, Medikamente umzufunktionieren, um wirksame und sichere antivirale Mittel zu entwickeln. Wirtsgerichtete Virostatika (HTAs) hemmen indirekt die virale Replikation, indem sie zelluläre Prozesse des Wirts hemmen und/oder antivirale Reaktionen stimulieren.
Die Autoren der vorliegenden Studie haben zuvor gezeigt, dass Thiopurine, 6-Thioguanosin (6-TGo) und 6-TG die IAV (Influenza-A-Virus)-Replikation durch Aktivierung der unfolded protein response (UPR) hemmen und die virale Glykoproteinverarbeitung und -akkumulation stören.
Über das Studium
Die vorliegende Studie untersuchte, ob 6-TG und andere Thiopurine mit Coronavirus (CoV)-Glykoproteinen interferieren könnten.
Die Wirksamkeit von Thiopurin gegen schwere SARS-CoV-2-, humane CoV (HCoV)-OC43- und HCoV-229E-Replikationshemmung und Unterbrechung der viralen Ribonukleinsäure (RNA)-Synthese wurden bewertet. Zellkulturexperimente wurden unter Verwendung von 293T-Zellen, HCT-8 (menschliche ileozäkale Adenokarzinom-Zelllinie), Huh7.5 (menschliche Hepatom-abgeleitete Zelllinie), primäre menschliche Telomerase-Reverse-Transkriptase (hTERT)-immortalisierte Fibroblasten und Calu-3 (Lungen-Adenokarzinom-Zelllinie) durchgeführt Zelllinie) Zellen.
Darüber hinaus wurde die Freisetzung von Viruspartikeln durch quantitative Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktionsanalyse (RT-qPCR) von extrazellulären Virusgenomen bewertet. Eine Immunfärbungsanalyse unter Verwendung von HCoV-OC43-infizierten Zellen wurde für Anti-Nucleocapsid (N)-Antikörper und doppelsträngige RNA (dsRNA) durchgeführt. Es wurden Ribopuromycinylierungsassays durchgeführt und 293T-Zellen wurden mit Plasmiden transfiziert, die SARS-CoV-2-Strukturproteine wie N-, Spike- (S), Membran- (M) und Hüllproteine (E) codieren, um die Auswirkungen von 6-TG auf SARS zu bewerten -CoV-2-Strukturproteine.
Darüber hinaus wurde SARS-CoV-2 S ektopisch exprimiert und mit mehreren 6-TG-Konzentrationen verglichen, woraufhin eine Immunblotting-Analyse mit Pseudovirionen (PV) durchgeführt wurde. S-exprimierende 293T-Zelllysate wurden mit PNGase F (Peptid-N-Glycosidase) behandelt, um N-verknüpfte Glykane aus Polypeptidketten zu eliminieren, und die Wirkungen von 6-TG auf den Sekretionsweg wurden durch Gaussia-Luciferase-Assays bewertet.
Durchflusszytometrie (FC)-Analyse und Oberflächenfärbung von S-exprimierenden 293T-Zellen wurden durchgeführt, um die S-Sekretion zu messen, und die Zellen wurden mit EGFP+ (Enhanced Green Fluorescent Protein)-Plasmiden co-transfiziert, um Veränderungen in der S-Protein-Akkumulation zu beurteilen.
Darüber hinaus wurden Zell-Cotransfektionen mit SARS-CoV-2-Strukturproteinen und Plasmiden durchgeführt, um die fehlerhaften Montagemechanismen aufzuklären, und das Team stellte fest, ob bekannte 6-TG-Ziele Reifungsdefekte des S-Proteins verursachen. Das Team bewertete auch mögliche morphologische Veränderungen von HCoV nach der 6-TG-Behandlung durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Analyse.
Ergebnisse
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6-TG hemmte das Anfangsstadium der SARS-CoV-2- und HCoV-OC43-Replikation, wodurch das virale Genom in voller Länge, Strukturproteine und die Akkumulation von subgenomischer RNA eingeschränkt wurden. Die ektopische S-Expressionsanalyse zeigte eine verbesserte elektrophoretische Mobilität des S-Proteins von mehreren βCoVs durch 6-TG-Behandlung, in Übereinstimmung mit der enzymatischen In-vitro-Eliminierung von N-verknüpften Oligosacchariden aus dem S-Protein. SARS-CoV-2-VLPs (virusähnliche Partikel) in 6-TG-behandelten Zellen fehlte das S-Protein.
Ähnliche 6-TG-Effekte wurden bei der SARS-CoV-2-S-pseudotypisierten Lentivirus-Produktion beobachtet, was zu S-defizienten Pseudoviren führte, die Angiotensin-Converting-Enzym-2 (ACE2)-exprimierende Zellen nicht infizieren konnten. Die Ergebnisse zeigten, dass die 6-TG-Behandlung zu einer fehlerhaften S-Protein-Verarbeitung und -Transport führte und dadurch die Ansammlung infektiöser Nachkommenviren behinderte. Die Umwandlung von 6-TG in seine Nukleotidform (nt) durch HPRT1 (Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase 1) war jedoch für die antivirale Aktivität unerlässlich, die durch ML099, einen Guanosin-5'-Triphosphat (GTP)ase-Agonisten, überwunden werden konnte.
Keine GTPase-Inhibitoren [Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1), Ras homolog family member A (RhoA), and Cell division control protein 42 homolog (CDC42)] beeinflusste die S-Akkumulation oder -Verarbeitung, was anzeigt, dass 6-TG die S-Reifung durch Hemmung einer unbekannten zellulären GTPase hemmte. 6-TG, 6-Thioguanosin (6-TGo) und 6-Mercaptopurin (6-MP) verursachten vier logarithmische Reduktionen der SARS-CoV-2-Virionfreisetzung und 6-TGo zeigte eine vergleichbare Hemmung von HCoV-OC43 und HCoV-229E, wohingegen 6-MP unwirksam war. Die RT-qPCR-Analyse zeigte, dass die 6-TG-Behandlung die HCOV-OC43-Titer am ersten Tag der Infektion um das 20-fache reduzierte.
Die mutmaßliche genomische virale RNA in voller Länge war in den meisten Stadien der Infektion um das 10-fache reduziert. Die 6-TG-Behandlung verursachte ähnliche Reduktionen der viralen S- und N-kodierenden subgenomischen RNA, was mit einer geringeren Proteinakkumulation korrelierte. Die Immunfärbung HCoV-OC43-infizierter Zellen mit Anti-N-Antikörpern zeigte zunächst eine punktförmige Färbung und anschließend eine periphere Färbung. Nach der 6-TG-Behandlung waren die gefärbten Bereiche heller, wobei große Punkte nach 24 Stunden nach der Infektion (hpi) beobachtet wurden. Die Immunfärbung für dsRNA zeigte beträchtlich reduzierte dsRNA-Signale unter 6-TG-behandelten Zellen.
6-TG verzögerte oder unterdrückte UPR-Downstream-Transkriptionsreaktionen, beeinflusste jedoch nicht die Translationsinitiationsraten in HCoV-OC43-infizierten Zellen. Die 6-TG-Hemmung der HCoV-OC43-Infektion beschränkte die Aktivierung des Inositol-erfordernden Enzyms 1 (IRE1) und die Akkumulation des X-Box-Bindungsproteins 1 (XBP1s) des Zielgens. Die Ergebnisse zeigten, dass, obwohl 6-TG die virale genomische und subgenomische RNA-Synthese in voller Länge störte, die Abschaltung des Wirts unbeeinflusst blieb.
6-TG verringerte die Expression des SARS-CoV-2-Strukturproteins (insbesondere S), und die Immunblotting-Analyse zeigte eine S-Bande mit hohem Molekulargewicht, die auf das S0-Vorläuferprotein hinweist, das auch empfindlich auf eine PNGaseF-Behandlung reagierte. Die Ergebnisse der elektrophoretischen Mobilitätsanalyse zeigten, dass 6-TG die S-Glykosylierung und -Verarbeitung hemmte, und Gaussia-Luciferase-Experimente zeigten, dass 6-TG keine Unterbrechung des globalen Sekretionswegs verursachte. Die TEM-Analyse zeigte weniger Viruspartikel in 6-TG-behandelten Zellen.
Fazit
Insgesamt hoben die Studienergebnisse kleine GTPasen als potenzielle HTA-Ziele hervor, und die Auswirkungen von 6-TG auf S in mehreren Modellen, wie z. B. ektopische Expression, authentische HCoV-Infektionen und die Produktion von PVs und VLPs, weisen auf einen antiviralen Mechanismus hin, der über den Papain-ähnlichen hinausgeht Protease (PLpro)-Hemmung.
Referenz:- Pringle, E. et al. (2022) "Thiopurine hemmen die Coronavirus-Spike-Proteinverarbeitung und den Einbau in Nachkommen-Virionen", PLOS Pathogens, 18(9), p. e1010832. doi: 10.1371/journal.ppat.1010832. https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1010832
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